Un oxydant est nécessaire afin de provoquer la luminescence du luminol. Habituellement, une solution de péroxyde d'hydrogène (H2O2 , appelée aussi eau oxygéné) et un sel hydroxyde acqueux est utilisée comme activateur. En présence d'un catalyseur -comme un composé ferreux- le péroxyde d'hydrogène est décomposé en eau et en dioxygène: 2H2O2->O2+2H20.
Ici, le catalyseur utilisé est le fer (Fe²+) présent dans l'hémoglobine.
Lorsque le luminol réagit avec le sel hydroxyde, un dianion se forme. L'oxygène issu de la décomposition du péroxyde d'hydrogène réagi alors avec ce dianion. Le produit de cette réaction, un péroxyde organique, est très instable et se décompose immédiatement avec une perte d'azote pour produire de l'acide 5-aminophtalique possédant des électrons dans un état excite. La désexcitation de ces électrons provoque l'émission d'énergie sous forme d'un photon de lumière bleu visible.
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